|
BÖLÜM 1. Moleküler Biyolojide Kullanılan
Yöntemler: Genel Bakış 1
! .1.
Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri
4
1.1.1. Fiziksel
Yöntemler 4
1.1.2
Kimyasal Yöntemler 7
1.2. Ayırma
(Separasyon), Saflaştırma (Pürifikasyon) ve Analiz
Yöntemleri 8
Süzme
(Filtrasyon) 8
Diyaiiz 10
Dondurarak Kurutma
(Liyofilizasyon) . 12
Çöktürme 13
Enzim Uygulaması
13
Santrifüjlerde
14
Krornatografi 23
Elektroforez 30
Spektral Yöntemler
39
Radyoizotopların
Kullanımı
46
İmmünolojik
Yöntemler 50
riiikleik Asit
Melezlemesi (Hibridizasyon>. . . .' 51
Elektron
Mikroskopisi 51
Yapı Analizleri .■
52
BÖLÜM 2. DNA'nın
İzolasyonu ve Analizi. 54
2.1. Kromozom
DNA'sı İzolasyonu , 57
2 .1.1.
Bakterilerden Kromozom (Genom) DNA'sı izolasyonu 57
Mayalardan
Kromozom DNA'sı izolasyonu 59
Memelilerden
Kromozom DNA'sı İzolasyonu 60
Bitkilerden
Kromozom DNA'sı izolasyonu 62
2.2. Kromozom
Dışı DNA'nın İzolasyonu 63
Plazmid DNA'sı
İzolasyonu 64
Organel
DNA'sı izolasyonu 65
2.3. DNA'nın
Analizi 67
Spektral Yöntemler
67
Elektroforetik
Yöntemler 68
2.3.2.1. Agarozlel
Elektroforezi 68
2.3.2.2 "Pulse
Field" Jel Elektroforezi 73
2.3.3. DNA'mrt
Enzimatik Kesimi 73
Restriksıyon
Endonükleazlarının Pratikte Kullanımı 75
DNA'nın
Restriksiyon Endonükleazları ile Kesilmesi 76
BÖLÜM 3. RNA'nin
İzolasyonu ve Analizi 81
3.1. Total RNA
İzolasyonu 82
3.1.1 Gram (-)
Bakterilerden Total RNA izolasyonu 82
Gram (+)
Bakterilerden Total RNA izolasyonu 83
Mayalardan Total
RNA izolasyonu . . 84
Memeli
Dokularından Total KNA İzolasyonu 86
Bitkilerden
Total RNA İzolasyonu 87
Organel
(mitokondri] RNA'sı
izolasyonu 88
mRNA'nın
İzolasyonu 88
RNA'nın
Analizi 90
Spektral Yöntemler
90
Elektroforetik
Yöntemler 91
BÖLÜM 4. Bakteri
Transformasyonu 95
Kimyasal
Uygulama ile Transformasyon 96
Elektroporasyon ile Transformasyon
(Elekrratrgnsformasyon) 98
BÖLÜM 5. DNA'nın
Polİnıeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Çoğaltılması 101
i'olimeraz
Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması .'.
102
PCR'nin
Temel Bileşenleri ■ 102
53. PCR'nrn
İşleyişi 109
5.4. PCR ile
Doğru Ürünün Çoğaltılması 110
PCR Ürünlerinin
Belirlenmesi ve Analizi : 111
PCR'de
Kontaminasyondan Korunma 112
5-5. PCR
Çeşitleri i ....'. ; 113
Yuvalanmış
("Nested") PCR ". '. , 113
Demirlenmiş
("Anchored") PCR ...„■..; 113
Geri
("Revers") Transkripsiyon PCR'si
(RT-PCR) V. 114
Asimetrik PCR 115
Ters ("Inverse")
PCR (IPCR) 115
İn sitü PCR
116
Çoklu (Mültipleks)
PCR 116
Rastgele
Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD)
116
İmmiino
PCR 117
5.6- Polimeraz
Zincir Reaksiyonu ile HyHel 10 ScFv Geninin
Çoğaltılması 117
BÖLÜM 6. Nükleik Asit
Melezlcmesine Dayalı Yöntemler 121
6.1. İn
situ Melezleme (Hibrîdizasyon) 123
6.1.1. ISH
için Biyolojik Materyal Hazırlama 125
6.1.1.7.
Dokunun Fiksasyonu 125
Lamların
Hazırlanması. . 126
Kesit Alma 126
Gutun Halinde
Hazırlanan Preparatlar 127
Materyale
Uygulanan Ön işlemler .127
6.1.2.
Denatûrasyon, Melezleme ve Yıkamalar .128
Melezleme
Öncesi işlemler
(Prehibridızasyon) . 128
Denatürasyon 128
Melezleme
(Hibridizasyon) 129
Melezlenme Sonrası
Yıkamalar (Posthibridizasyon) 130
6.1.3. İn situ
Melezleme Bölgelerinin Saptanması 131
6.1.3.1.
Radyoaktif Olmayan Probların Saptanması 131
6.1.4. İn sıtu
Melezleme Problarının Seçimi
135
Prob Tipleri 135
Prob Uzunluğu 136
Probun
İşaretlenmesi 137
Oligonükleotid
Problan Di^oksigenin
ile
İşaretleme
(Boehringer Mannheim'in protokolünden) 138
6.1.5. in situ
Melezlemede Kontrol 139
6.1.6. \n
situ Melezlemede Ortaya Çıkan Sorunlar ve
Çözümleri 140
b.lJ. Parafin
Kesitlere DIG-/n situ Melezleme (ISH) 140
6.2. Southern
Emdirimi ("Blotting") ve D(G Sistemi 147
Digoksİgenin
(DIC) Sistemi: Prob
işaretlenmesi .ve Belirleme 147
HyHel 10 ScFv
Ceninin Prob Olarak İşaretlenmesi ve Belirlemesi 149
6.3. Northern
Emdirimi ("Blotting"} ve Melezleme 155
BÖLÜM 7. Proteinlerin
İzolasyonu, Analizi ve Saflaştırılması 161
Alet, Malzeme
ve Kimyasal Maddeler . . . .■ 161
Protein
Ekstresinin (Özütünün) Hazırlanması ......' 164
Protein Kaynağı
Biyolojik Objeler 164
Protein
Ekstraksıyonu ■. ■ 166
Saklama Koşulları
■ 169
7.3.
Çözunebilen ("Soluble") Protein
Ekstraksiyonlarmdan Örnekler 169
Memeli
Dokularından Ekstraksiyon 169
Eritrositlerden
Ekstraksiyon 170
Yumuşak Bitkisel
Dokulardan Ekstraksiyon 1 70
Soya Fasulyesi
Kotiledonlanndan Ekstraksiyon 171
Bitki Doku
Kültürlerinden Ekstraksiyon 171
Mayalardan
Ekstraksiyon 171
Bakterilerden
Ekstraksiyon . 173
Yağlı Dokulardan
Ekstraksiyon 1 74
Membran
Proteinlerinin
Ekstraksıyonu 1 74
Protein
Konsantrasyonunun (Derişiminin] Belirlenmesi
177
A280/A260 Oranı
(VVarburg - Christian Yöntemi) 178
Biüret Yöntemi 179
Boya-Bağlama
(Bradford] Yöntemi 17C)
Lowry Yöntemi 181
7.6. Pıotein
Ekstresinin Konsantre Edilmesi 182
Kuru Pohmer Kullanımı
182
Ultrafiltrasyon 182
Diyaliz 183
Çözeltinin Diyalizle
Konsantre Edilmesi 186
Küçük Moleküllerin
Diyalizle Uzaklaştırılması 187
Liyofilızasyon 187
Çöktürme 189
Trikloroasetîk Asit
(TCA) ile Çöktürme 189
Organik Çözücülerle
Çöktürme 189
Tuzla Çöktürme 190
Polietilen Glikol
(PEG) ile Çöktürme 193
7.7. Protein
Elektroforezi 193
Doğal lel
Elektroforezi 200
Doğal Olmayan
(Denatüre) lel Elektroforezi: SDS-PAGE 204
Düşük Molekül
Ağırlıklı Polipeptidlerin Elektroforezi 211
Izoelekîrik Odaklama
ve İki Boyutlu Elektroforez (2-DE] 213
Birinci Boyut:
izoelektrik Odaklama -. 214
İkinci Boyut: SDS-PAGE
(Şekil 7.15) \ 220
Sonuçların
Değerlendirilmesi '. 221
7.7.5. Boyama ile
Saptama . 223
Coomassie Boyama ' '.
224
Hızlı Comassie Boyama
225
Gümüş Boyama ', . .
, . ■ 227
Hızlı
Gümüş Boyama 1 . .- 228
7.7.6. Membrana
Aktarımla Saptama: Western Emdirimi ("Blotting") 230
Western Emdirimde Ön
İşlemler: Örneklerin Hazırlanması ve Elektroforez 235
|el Üzerindeki
Proteinlerin Membrana Aktarımı . . .■ 237
Aktarımın Kontrolü ve
Membranın Boyanması 241
İmmünolojik Saptama
("Immunodetection") 243
Alternatif Saptama
Yöntemleri 246
Glikoproteinlerin
Lektinlerle Saptanması 247
7.7.7. Elektroforetik
Tekniklerde Karşılaşılan Sorunlar ve Çözüm Önerileri 24S
Tek Boyutlu
Elektroforez (Doğal ve Denatiire PACE) 248
İki Boyutlu
Elektroforez 252
Membrana Aktarım
(Western Emdirimi) 255
7.8. Proteinlerin
Saflaştırılması 257
7.8.1. İyon Değişimi
Kromatografisi 259
7.8.1.1 - Proteinlerin
İyonik Elüsyonla Kolondan Ayrılması 265
7.8.1.2. iyon
Değiştiricilerde Afinite Elüsyonu ve Diğer Spesifik Olmayan
Adsorbanlar 265
7.8.2. İlgi
(Afinite) Kromatografisi 266
Ligandların
Sınıflandırılması 266
Kromatografi Koşulları
268
7.8.3. Yalancı İlgi
(Psödoafinite) Kromatografisi 269
7.8.3.1. Boya
Ligand Kromatografisi 269
Hıdrofobik
Etkileşim Kromatografisi 270
jel Geçirgenlik
Kromatografisi 270
Yüksek Basınçlı
Sıvı Kromatografisi {HPLC) 272
Kristallendirme ve
Saflık Kontrolü 273
BÖLÜM 8. Enzimatik
Analiz ve Aktivite Belirleme Yöntemleri 275
8.1. Enzimatik
Analizin Teme] İlkeleri 275
Başlangıç Hızının
Tanımlanması 277
Başlangıç Hızına
ilişkin Sapmalar 277
8.2. Enzim
Aktivite.sinin Tanımlanması ve Ölçülmesi 280
Aktivite Ölçüm
Koşulları 281
Aktivite
Ölçümlerinde Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar 282
Enzim
Aktivitesinin Hesaplanması: Birimler ve Spesifik
Aktivile 282
8.3.
Enzimlerle İlgili Deneysel Bilgiler 285
Doğrudan ve
Devamlı Ölçüm 285
Dolaylı Ölçüm;
.; 287
Kesikli Dolaylı
Yöntem i 288
Devamlı Dolaylı
Yöntem 289
Çift Enzim Yöntemi
("Coupled Assay") ■'. ; 290
8.4. Enzim
Aktivitesinin Jel Üzerinde Gösterilmesi 291
8.4.1. Peroksidaz
Aktivitesinin Poüakrilamid Jel Üzerinde Gösterilmesi 291
8.5. Enzim
Kinetiği ■..;.:. 292
Enzim Kinetiğinin
Temel Bağıntıları 293
Kinetik Değerlerin
Saptanması İçin Enzim Aktivite Ölçümleri 296
Somut Değerlere
Dayalı Kinetik Çalışma Örneği 301
Ekler : 303
İndeks 339
|
